موضوع فى التنوع الوراثي للشعير في اليمن باستخدام مؤشرات المقاطع البسيطة المتكررة (SSR)

المقدمة:

يعد الشعير(LHordeum vulgare) من أكثر محاصيل الحبوب الاقتصادية تحملاً للتباينات المناخية،
حيث يزرع في مناطق متنوعة تمثل مدى بيئيا واسعا (Ceccarelli et al. 1995).

يتميز القطر اليمني بتنوع مناخي واسع
يختلف باختلاف مناطقه الجغرافية حيث يمكن ملاحظة الاختلاف حتى على مستوى
المنطقة الواحدة، فمثلا يتواجد في إقليم المرتفعات الوسطى السلاسل الجبلية
التي يتفاوت ارتفاعها ما بين 1500-3500مترٍ، يرافقه
تباين مناخي كبير (أبو غانم 2004، مكرد 1998). يرافق
هذا التباين وجود قاعدة وراثية واسعة وتنوع وراثي كبير، حيث تمتلك اليمن
نحو2500 نوعًا نباتياً
من إجمالي 3418نوعاً نباتياً
تتواجد في الجزيرة العربية ( الخرساني، 2005؛ باوزير، 2004).

تعتبر معرفة التنوع الوراثي للمصادر
الوراثية والعلاقات الوراثية فيما بينها معلومات أساسية وجوهرية بالنسبة
لمربي النبات وذلك لفائدتها في تصميم برامج التربية والتحسين وفي تحسين
كفاءة عمليات إدارة الأصول الوراثية والحفاظ عليها من الانجراف الو راثي (Russell et al. 1997a).

تعد التباينات الشكلية من المعايير
الأولى التي استخدمت في عملية التوصيف والتصنيف ودراسة التباينات بين وضمن
الأنواع المختلفة. إلا أنه في الآونة الأخيرة وفي ظل التطور المتسارع في
علم التقانات الحيوية، فقد اكتشفت معايير ومؤشرات أكثر دقة يمكنها تحقيق
هذا الهدف وتطويره. لقد أدى تطور التقانات الحيوية إلى ظهور عدد كبير من
المؤشرات الجزيئية الهامة التي تسمح بتوصيف الكائنات الحية والتمييز حتى
بين الوحدات التصنيفية الصغيرة، ومن بينها مؤشرات المقاطع البسيطة المتكررة
Simple Sequence Repeats (SSR)والتي تسمى أيضا بمؤشرات المايكروساتوليت Microsatellite markers.

تعتبر مؤشرات المقاطع البسيطة المتكررة (SSR)من المؤشرات الجزيئية الهامة جداً
والواسعة الانتشار حالياَ. تتكون هذه المؤشرات من مقاطع صغيرة متكررة، تسمى
وحدات متكررة، تتواجد بكثرة في مجينات حقيقيات النوى وتتوزع على جميع
الصبغيات سواء في المنـاطق المشفرة أوغير المشفرة. (Powell et al.,, 1996)تتكون
الوحدات المتكررة من عدد من أزواج النيوكليوتيدات يتراوح بين (6-1)، كما تحاط هذه الوحدات بمقاطع
نيوكليوتيدية تتواجد بمنطقة وحيدة في مجين أفراد النوع الواحد. تختلف
مؤشرات المايكروساتوليت فيما بينها من حيث، أماكن تواجدها ضمن المجين وعدد
الوحدات المتكررة المكونة لها، ونوعية نيوكليوتيدات الوحدات المتكررة.
تتواجد مؤشرات الـ SSRبكثافة ضمن مجين الفرد، حيث ذكر Wang et
al.(1994) بأن وجودها في مجين الشعير يتكرر مرة كل 165 Kpb(كيلو زوج من النيوكليوتيداتKbp )، كما وجد Liu, et al(1996) بأن تكرار وحدات (GA)nو(CA)n ضمن مجين الشعير هو مرة كل 330و260Kpbعلى التوالي. بالإضافة إلى ذلك، تتميز
هذه المؤشرات بارتفاع مستوى التبايناتpolymorphism
التي تكشفها مقارنة بعدد من التقانات
الأخرى Russell et al, 1997a); Struss and Plieske, 1998;;Rajora and Rahman, 2003
Chabane et al., 2005)، وكذلك بسهولة تطبيقها و تحليل نتائجها Macaulay et al., 2001);(Matus and Hayes,
2002.

استخدمت هذه المؤشرات في العديد من
الدراسات ذات الأهداف المختلفة مثل إنشاء خرائط الارتباط الوراثية لعدد من
الصفات الهامه ولأنواع نباتية مختلفة (Liu et al., 1996; Ramsay et al., 2000;
Karakousis et al., 2003; Baum et al., 2004; Emebiri et al., 2005;
Hamwieh et al., 2005; Von-Korff et al., 2006).، وفي دراسة التنوع الوراثي (Struss
and Plieske, 1998;

Choumane et al., 2000; Khlestkina et al.,
2004; Ozkan et al;., 2005; Ordon et al., 2005) و كذلك في التمييز بين الأنواع وتوضيح العلاقات التطورية و
تصنيف المجموعات الوراثية (Russell et
al. 1997bStruss and
Plieske, 1998;;Choumane et al. 2002; Matus and Hayes, 2002 ; Baek et
al. 2003;Malysheva-Otto
et al., 2006 ; Feng et al. 2006 ; ).

الهدف:

هدفت هذه الدراسة إلى تقدير التنوع
الوراثي لمدخلات من الشعير ممثلة لمناطق زراعته في اليمن وذلك باستخدام
مؤشرات مقاطع الـ DNAالبسيطة
المتكررة (SSR)، ومن ثم
تحديد القرابة الوراثية بين المدخلات المستخدمة، وفي النهاية البحث عن
علاقة بين التباينات الوراثية المكتشفة والمواقع الجغرافية التي جمعت منها
المدخلات.

أجريت المراحل الأولى من البحث في مخبر
الوراثة الجزيئية في كلية الزراعةـ جامعة تشرين، في حين أنجزت المراحل
اللاحقة في مخبر التقانات الحيوية في المركز الدولي للبحوث الزراعية في
المناطق الجافة (إيكاردا)، حلب، سوريا، خلال عامي 2005و2006.

المواد وطرائق
العمل:

المادة
النباتية:

استخدم 135مدخلاًAccessions من الشعير المزروع (Hordeum vulgare.
L)في اليمن. تم الحصول على البذور التي
تمثل مناطق مختلفة جغرافيا وبيئياً من بنك الأصول الوراثية التابع للهيئة
العامة للبحوث الزراعية اليمنية (جدول 1، شكل 1).

تمت زراعة بذور (حبوب) الشعير في أصص
صغيرة بواقع أربع بذور من كل مدخل في كل أصيص. تراوحت درجة الحرارة خلال
فترة الزراعة ما بين 18– 22^oم و تناوبت ساعات الإضاءة بين 12ساعة ضوء و12ساعة
ظلام.

جدول 1: عدد مدخلات الشعير
المستخدمة في الدراسة وأماكن جمعها.

المناطق (المحافظة)	عدد المدخلات	المناطق (المحافظة)	عدد المدخلات	المناطق (المحافظة)	عدد المدخلات
صنعاء	30	البيضاء	8	مأرب	7
ذمار	25	صعده	8	حجة	4
اب	25	عمران	7	أبين	2
تعز	12	المحويت	7	المجموع	135

شكل 1: التوزع الجغرافي
للمناطق التي جمعت منها مدخلات الشعير المستخدمة في الدراسة.

استخلاص الأحماض النووية: DNA extraction

تم استخلاص المادة الوراثية (الـ (DNAمن أوراق نباتية فتية بعمر أربعة أسابيع
ومن نباتات مفردة. استخدم نبات واحد من كل مدخل وأجريت عملية الاستخلاص
حسب تقنية Benito et al., (1993).

تم تقدير كمية الـ DNAالمستخلصة بواسطة مقياس الطيف الضوئي Spectrophotometerو اختبرت نوعية الـ DNAعلى هلامة ذات تركيز 1% من الأجاروز ومن
خلال عملية الرحلان الكهربائي الأفقي.

تم تخفيف وتوحيد تراكيز المادة الوراثية
لجميع العينات للحصول على 25نانوغرام من الـ DNA/ميكروليتر.

التفاعل التسلسلي للبوليميراز: Polymerase Chain Reaction (PCR)

تم استخدام 25زوجاً من بادئات الـ (SSR)المستخلصة من الشعير والموسومة عند
النهاية ‘5بصبغة متوهجة ذات ألوان مختلفة Fluorecnce-dye(جدول 2). تتميزهذه البادئات primersبمواقع محددة وموزعة على صبغيات
الشعير السبع (Russell et al.,, 2003).

أجري التفاعل في حجم نهائي قدره 10ميكروليتر. استخدم 50نانوغراما من الـ DNAو 200ميكرومول من كل من النيوكليوتيدات الأربعة (dTTP/dATP/dCTP/dGTP)و30بيكومول من كل من البادئتين و0.4وحدة من أنزيم التكثيف Taq DNA polymerase.

أجريت عملية المكاثرة Amplificationفي جهاز الدوران الحراري Perkin Elmer Applied-9700وفق البرنامج
الحراري التالي، دورة واحدة بدرجة حرارة 94^oم لمدة 5دقائق ثم 35دورة تتكون كلٌ منها من المراحل التالية (94^oم لمدة 30ثانية،58 ^oم لمدة 15ثانية، 72^oم لمدة 15ثانية )
ثم تركت العيناتلمدة7دقائق على حرارة 72^oم.

جدول (2): أسماء
البادئات المستخدمة في التحليل ومواقعهاعلى الصبغيات

موقع البادئة على الصبغي Chromosomal position	البادئات Primers	موقع البادئة على الصبغي Chromosomal position	البادئات Primers
2H	Scssr7759	1H	Bmag211
2H	Scssr8447	6H	Bmac0316
5H	Scssr10148	1H	Bmag382
7H	Scssr15864	2H	Bmag 378
3H	Scssr25691	H	Bmag749
6H	Bmag18	H	Bmag813
5HL	GMS1	5H	Scssr2306
3H	HVLTPPB	1H	Scssr2748
4H	HVM67	5H	Scssr3907
5H	HVLOX	6H	Scssr5599
H4	Scssr20569	5H	Scssr5939
7H	Sscssr4056	5H	Scssr07106
		7H	Scssr7970

الرحلان الكهربائي وتحليل
الهلامات: Electrophoresis and gel
analysis

تم تجهيز العينات عن طريق مزج نواتج
مكاثرة ثلاث بادئات موسومة بألوان مختلفة (أصفر- أزرق – أخضر) وذات أوزان
جزيئية متباينة. حمّلت العينات على هلامة أكريلامايد ذات تركيز %6. أجريت عملية الرحلان الكهربائي على
جهازالتتالي
النيوكليوتيدى الآلي ABI Prism^TM 377 DNA
Sequencer، ومن خلال برنامجي Genscanو Genotyperالمرتبطين مباشرة بجهاز ِABI 377 Sequencer، تم تحليل صور الهلامات وتحديد الوزن الجزيئي لقطع الـ DNAالمكاثرة مع البادئات المختلفة. تم تجميع
نتائج كل البادئات والبيانات الخاصة بها في جداول خاصة لاستخدامها لاحقاً
في التحليل.